Nació el 31 de agosto de 1870 en Chiaravalle, provincia de Ancona, Italia, en el seno de una familia burguesa católica. Sus padres fueron Renilde Stoppani y Alessandro Montessori, militar de profesión y hombre muy estricto; sin embargo, en su familia se reconocía el derecho a cierta educación de la mujer.

Estudió ingeniería a los 14 años, luego estudió biología y por último fue aceptada en la Facultad de Medicina de la Universidad de Roma «La Sapienza». Su padre se opuso al principio pero a pesar de ello terminó graduándose en 1896 como la primera mujer médico en Italia. Fue miembro de la Clínica Psiquiátrica Universitaria de Roma. Más tarde, estudió antropología y obtuvo un doctorado en filosofía, época en la que asistió a uno de los primeros cursos de psicología experimental. Es contemporánea de Freud y desarrolló su propia clasificación de enfermedades mentales.

Cuando se unificaron las provincias italianas y se independizó Italia, hubo un deterioro en la situación económica del país. En ese momento, se interesa por las condiciones sociales, especialmente de las mujeres. Participa en dos congresos internacionales para mujeres: uno celebrado enBerlín en 1896 y otro en Londres en 1900. Habló de las mujeres y de los niños, enfatizando las repercusiones que las condiciones de vida tienen sobre la sociedad. En 1898, en un congreso en Turín expuso la importancia de la educación y atención a niños con deficiencias mentales y planteó la relación entre el abandono infantil y el desarrollo posterior de la delincuencia.